Abstract The objective of this study was to identify Eimeria spp. in alternative poultry production systems (APPS) in the State of São Paulo, Brazil. Fecal samples (168) and DNA extracted from fecal samples obtained in APPS located in different Municipalities in the State of São Paulo (93) were examined by microscopy or genera-specific PCR (ITS-1 locus). Samples positive for Eimeria spp. were examined using Eimeria lata, Eimeria nagambie, and Eimeria zaria species-specific PCR protocols (ITS-2 locus) and another E. lata-specific PCR (candidate IMP1 genomic locus) followed by molecular cloning (E. lata and E. zaria ITS-2 amplicons) and genetic sequencing. All positive DNA samples were also submitted to genera-specific nested PCR (18S rRNA gene) followed by next-generation sequencing to identify Eimeria spp. Eimeria nagambie, E. zaria, and Eimeria sp. were identified by ITS2-targeted species-specific PCRs and genetic sequencing. Next-generation sequencing identified, in order of prevalence: E. nagambie; Eimeria acervulina; Eimeria mivati; Eimeria praecox; Eimeria brunetti; Eimeria mitis; Eimeria sp.; Eimeria maxima; E. zaria, and Eimeria necatrix/tenella. Our results confirmed, for the first time in Brazil, the identification of E. nagambie, E. zaria, and Eimeria spp. ITS-2 and 18S rRNA gene sequences not yet described in Brazil.

Resumo O objetivo deste trabalho foi identificar Eimeria spp. em galinhas domésticas criadas em sistemas de criação alternativos (SCA). Foram utilizadas 93 amostras de DNA e 168 amostras de fezes de galinhas provenientes de SCA, localizados em 17 municípios do estado de São Paulo. As amostras foram examinadas por microscopia ou PCR gênero-específica (locus ITS-1); aquelas positivas foram examinadas por PCRs espécie-específicas para Eimeria lata, Eimeria nagambie e Eimeria zaria (locus ITS-2), seguidas de clonagem (E. lata e E. zaria) e sequenciamento genético, e por outro protocolo de PCR específico para E. lata (locus IMP1). Adicionalmente, as mesmas amostras foram submetidas à nested PCR gênero-específica (gene 18S rRNA), seguida de sequenciamento de nova geração para identificação de Eimeria spp. Eimeria nagambie, E. zaria e Eimeria sp. foram identificadas pela PCR espécie-específica e sequenciamento genético. O sequenciamento de nova geração identificou, em ordem de prevalência: E. nagambie, Eimeria acervulina, Eimeria mivati, Eimeria praecox, Eimeria brunetti, Eimeria mitis, Eimeria sp., Eimeria maxima, E. zaria e Eimeria necatrix/tenella. Os resultados observados confirmaram, pela primeira vez no Brasil, a identificação de E. nagambie, E. zaria e de sequências de Eimeria spp. ainda não descritas no Brasil, referentes aos genes ITS-2 e 18S rRNA.

Resumo As leishmanioses são zoonoses causadas por mais de 20 espécies de protozoários do gênero Leishmania. As infecções são comumente disseminadas por flebotomíneos e causam um amplo espectro de manifestações clínicas. Portanto, a detecção e diferenciação de espécies de Leishmania são importantes do ponto de vista epidemiológico e terapêutico. O objetivo deste estudo foi combinar estratégias in silico e in vitro para avaliar a especificidade analítica dos primers descritos anteriormente na literatura. De acordo com a PCR eletrônica (e-PCR), 23 dos 141 pares de primers selecionados por meio de pesquisa da literatura estavam de acordo com a especificidade analítica anteriormente relatada. A avaliação in vitro de nove desses pares de primers, por PCR quantitativa (qPCR), confirmou a especificidade analítica de cinco deles ao nível de espécie de Leishmania, do complexo L. mexicana ou dos subgêneros Leishmania e Viannia. Com base nos resultados, sugere-se que a combinação de e-PCR e qPCR é uma abordagem valiosa para a validação e maximização da especificidade de novos pares de primers para o diagnóstico laboratorial de infecções com Leishmania spp.

Abstract Leishmaniasis is a zoonotic disease caused by over 20 species of protozoan parasites of the genus Leishmania. Infection is commonly spread by sandflies and produces a wide spectrum of clinical signs and symptoms. Therefore, from an epidemiological and therapeutic standpoint, it is important to detect and differentiate Leishmania spp. The objective of this study was to combinate in silico and in vitro strategies to evaluate the analytical specificity of primers previously described in the literature. According to electronic PCR (e-PCR) analysis, 23 out of 141 pairs of primers selected through literature search matched their previously reported analytical specificity. In vitro evaluation of nine of these primer pairs by quantitative PCR (qPCR) confirmed the analytical specificity of five of them at the level of Leishmania spp., L. mexicana complex or Leishmania and Viannia subgenera. Based on these findings, the combination of e-PCR and qPCR is suggested to be a valuable approach to maximize the specificity of new primer pairs for the laboratory diagnosis of infections with Leishmania spp.